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林可霉素

快速檢測試劑盒說明書

一、原理

    試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物林可霉素藥物和微孔條上預包被的偶聯(lián)抗原競爭抗林可霉素藥物抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留林可霉素藥物的含量成負相關，與標準曲線比較即可得出相應殘留物林可霉素藥物的含量。

二、試劑盒特性

• 試劑盒靈敏度：      0.1ppb
• 孵育溫度：          25℃
• 孵育時間：          30min～15min
• 樣本檢測下限

組   織  ······································   0.4ppb

飼   料  ·······································   1ppb

蜂   蜜  ······································    2ppb

• 交叉反應率

林可霉素   ····································   100%

• 樣本回收率

組   織  ······································  100±25%

飼   料  ·······································  95±25%

蜂   蜜  ······································  100±25%

三、試劑盒組成

四、所用儀器、試劑

具備的儀器：微孔酶標儀、打印機、均質器 、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）

微量移液器：單道 20～200ul、單道100～1000ul、多道 250ul 

五、樣本前處理步驟

• 樣本處理前須知

處理任何樣本時，都必須注意：

•  本試劑盒所檢測的組織樣本包括：動物組織、禽類和水產組織。eg:雞、鴨、豬、牛、兔、魚、蝦等。
•  實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。
•  實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結果。

• 樣本前處理需配制：

配液1  樣本提取液：  

       將去離子水與20X濃縮提取液按19:1稀釋。

• 樣本前處理方法：

（a）組織樣本（雞肉/肝、豬肉/肝、蝦、魚等）

1、稱2.0±0.05g 均質的組織樣本于50ml離心管中；

2、加入6ml樣本提取液，振蕩2min，4000r/min以上，15℃離心10min；

3、取上層50µl液體用于分析。

   樣本稀釋倍數：4

（b）飼料樣本

1、稱1.0±0.05g 粉碎的飼料樣本于50ml離心管中；

2、加入5ml樣本提取液，振蕩1min，4000r/min以上，15℃離心10min；

3、取上層200µl液體加入200µl樣本提取液，震蕩混勻，取50µl用于分析。

    樣本稀釋倍數：10

（c）蜂蜜樣本

1、稱1.0±0.05g 的蜂蜜樣本于50ml離心管中；

2、加入5ml樣本提取液，振蕩1min，4000r/min以上，15℃離心10min；

3、取上層200µl液體加入600µl樣本提取液，震蕩混勻，取50µl用于分析。

    樣本稀釋倍數：20

六、 酶標免疫分析程序:

• 測定前應須知：

• 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20-25℃）。
• 使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。
• 在ELISA分析中的再現性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。
• 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。

• 操作步驟：

• 將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出并將所需試劑從試劑盒取出，置室溫（20-25℃）平衡30min以上, 注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
• 按需要取出微孔條及板架，將不用的微孔板重新密封，保存于2-8℃，不要冷凍。
• 配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。
• 編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品均需做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
• 加標準品/樣本50µl /孔，然后加酶標記物50μl/孔，再加入抗體工作液50µl/孔。輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板，25℃環(huán)境反應30min。
• 取出并甩干孔內液體；用洗滌液按每孔250μl洗板4-5次，每次浸泡15-30秒，拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
• 顯色：每孔加入底物液A液50µl再加B液50µl，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境避光顯色15min。
• 測定：加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，在5min內讀完數據），測定吸光度值（OD值）。

七、結果判定

結果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含林可霉素藥物量成負相關。

1、粗略判定：

    用樣本的平均吸光度值與標準品比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設樣本1的吸光度值為0.238， 樣本2的吸光度值為0.946，標準液吸光度值分別是：0ppb為1.845； 0.1ppb為1.542；0.3ppb為1.130； 0.9ppb為0.635；2.7ppb為0.326； 8.1ppb為0.156。則樣本1的濃度范圍是2.7ppb - 8.1ppb；樣本2的濃度范圍是0.3ppb - 0.9ppb。乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中林可霉素藥物的實際濃度。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以第--個標準（0標準）的吸光度值，再乘以100%，即

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/L標準溶液的平均吸光度值

（2）標準曲線的繪制與計算

    以標準品百分吸光率為縱坐標，以林可霉素標準品濃度（ng/ml）的半對數為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中林可霉素藥物實際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。

八、 注意事項

• 室溫低于25℃或試劑及標本未回到室溫（20-25℃）會導致所有標準的OD值偏低。
• 在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會伴隨著標準曲線不成線性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。
• 混合要均勻，否則會出現重復性不好的現象。
• 反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
• 不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。
• 不用的微孔板放進自封袋重新密封；標準物質和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
• 顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。標準品1的吸光度值小于0.5時，表示試劑可能變質。
• 若樣本處理方法中檢測濃度不在曲線范圍內時，可將樣本稀釋一定倍數，使其可檢測范圍在曲線范圍內時檢測。
• 該試劑盒J反應溫度為25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

九、儲藏條件和保質期

• 儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，不要冷凍。
• 保 質 期：該產品有效期為1年，生產日期見包裝盒。

提示：酶標板真空包裝袋若有漏氣，酶標板仍然正常有效，不影響實驗結果，請放心使用。

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