組織、肝臟 ································

85%±20%

蜂蜜、腸衣 ································

83%±25%

牛奶、飼料 ································

75%±23%

尿液、血清 ································

70%±18%

三、試劑盒組成

1

微量測試孔

每條 8 孔，一板 12 條

標(biāo)準(zhǔn)液×6 瓶

0ppb

0.05ppb

2

0.15ppb

0.45ppb

（1ml/瓶）

1.35ppb

4.05ppb

3

酶標(biāo)記物

12ml

紅色帽

4

抗體濃縮液

1ml

藍(lán)色帽

5

底物 A 液

7ml

白色帽

6

底物 B 液

7ml

黑色帽

7

終止液

7ml

黃色帽

8

20X 濃縮洗滌液

40ml

白色帽

9

2X 濃縮復(fù)溶液

50ml

透明帽

(1 份濃縮復(fù)溶掖+1 份去離子水，用于抗體

氮氣流下干燥；用 0.5ml 樣本復(fù)溶液溶解干燥

的稀釋和樣本提取后的復(fù)溶)。

的殘留物，混合 30s；

u

樣本處理：

3、 取 50 µl 用于分析。

（a）組織、肝臟樣本處理方法

樣本稀釋倍數(shù)： 0.5 倍

1、 稱取均質(zhì)后的樣本 3±0.05g 于 50ml 離心管中，

檢測下限：0.025ppb

定量下限：0.1 ppb

先加入 3ml 去離子水混勻后再加入 6ml 乙酸乙

注：我們推薦 0.1 ppb 為陽性樣本的 cut off 值。

酯，振蕩 2min，室溫 4000r/min 以上離心 10min；

（e）腸衣處理方法

2、 取出 4ml 上層液體在 50-60℃氮氣流中吹干；

1、 用均質(zhì)器均質(zhì)樣本；注：干樣本需剪碎（長度

3、 加入 1 ml 正己烷溶解干燥的殘留物，再加 1ml

不超 5mm）后再均質(zhì)，濕樣本需用去離子水漂

樣本復(fù)溶液混合 30s，室溫 4000r/min 以上離心

洗 20min 以上去除表面的鹽份，瀝干后再均質(zhì)；

5min；去除上層有機相；

2、 稱 1±0.05g 均質(zhì)后的樣本于 50ml 離心管中，加

4、 取 50 µl 下層相用于分析。

入 10ml 乙酸乙酯，振蕩 2min，室溫 4000r/min

樣本稀釋倍數(shù):  0.5 倍

以上離心 10min；

（b）血清血漿處理方法

3、 取 5ml 上層液體（相當(dāng)于 0.5g 的樣本）在氮氣

1、 取 1ml 血清或血漿至試管中，加 2ml 乙酸乙酯

流下 50-60℃干燥；

振蕩 1min；靜置使水相與有機相分層或室溫

4、 加入 1 ml 正己烷溶解干燥的殘留物，再加 0.5ml

4000r/min 離心 5min；

樣本復(fù)溶液振蕩混合 30s，室溫 4000r/min 以上

2、 移取上層的乙酸乙酯至另一試管中，用氮氣流

離心 5min；除上層有機相；

50℃水浴中干燥；殘留物用 1 ml 樣本復(fù)溶液溶

5、 取下層 50 µl 用于分析。

解，混合 30s；

樣本稀釋倍數(shù)： 1 倍

3、 取 50 µl 下層相用于分析。

（f）牛奶樣本處理方法一

樣本稀釋倍數(shù):  1 倍

1、 將牛奶樣本 10℃4000r/min 以上離心 10min 處

（c） 尿液處理方法

理，吸除上層脂肪；然后取 5ml 去除脂肪奶樣

1、 移取 2ml 尿液到離心管中，加 pH4.8 100mM 醋

至 50ml 離心管中，加入 150µl C 液出現(xiàn)沉淀，

酸鈉緩沖液 0.5ml 混合；加 40µl 葡萄糖苷酸酶

短暫振蕩后加入 150µl D 液混合；

(Merck,Art.No.4114)到稀釋的尿液中，在 37℃

2、 15℃4000r/min 以上離心 10min，移取上層液；

水解至少 2 小時（或過夜）；

用樣本復(fù)溶液以等體積稀釋上層液，混合 30s；

2、 該溶液恢復(fù)至室溫后加入 8ml 乙酸乙酯混合

3、 取 50µl 用于分析。

1min；室溫 4000r/min 離心 10min，取出 4ml

注：如果離心后仍然渾濁，再重復(fù)沉淀過程。

上層液體在氮氣下 50～60℃干燥；

樣本稀釋倍數(shù)：2

3、 用 1ml 樣本復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，混合

檢測下限：0.1ppb

定量下限：0.15ppb

30s；

（g）牛奶樣本處理方法二

4、 取 50µl 用于分析。

1、 將牛奶樣本 10℃4000r/min 以上離心 10min 處

樣本稀釋倍數(shù):  1 倍

理，吸除上層脂肪；然后取 5ml 去除脂肪奶樣

（d）蜂蜜處理方法

至 50ml 離心管中，加入 250µl C 液和 250µl D

1、 取 2±0.05 g 蜂蜜，放入離心管中，用 4ml 去離

液*混合，4-12℃4000r/min 以上離心 10min。

子水溶解；加入 4ml 乙酸乙酯振蕩 2min，室溫

如無冷凍離心機，將樣本置冰箱中冷卻到 8℃；

4000r/min 以上離心 10min；

2、 轉(zhuǎn)移出 2.2ml 上層液（相當(dāng)于 2ml 奶樣）至新

2、 移取 2ml 上層清澈液到另一離心管中，50-60℃

的離心管中，加入 4ml 乙酸乙酯上振蕩 2min；

檢測下限：0.1ppb

定量檢測限：0.3ppb

7、 將孔內(nèi)液體甩干，用已稀釋的洗滌液 250µl/孔

（j）飼料處理方法

洗板 4～5 次，每次間隔 15～30 秒，用吸水紙

1、 稱取 2±0.05g 均質(zhì)過的飼料樣本，加入 2ml 去

拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺

離子水，再加入 6ml 乙酸乙酯，充分振蕩 2min，

破）。

15℃ 4000r/min 以上離心 10min；

8、 每孔加入酶標(biāo)記物100µl，蓋板膜蓋板后置25℃

2、 取 3ml 上層有機相到試管中 56℃下氮氣吹干；

環(huán)境中反應(yīng) 30min。將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌

3、 加入 1ml 正己烷溶解殘留物，用 1ml 樣本復(fù)溶

液充分洗，4～5 遍（同上），用吸水紙拍干（拍

液混合 30s，室溫 4000r/min 以上離心 5min；去

干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

除上層有機相；

9、 顯色：加入底物 A 液 50µl/孔，再加入底物 B

4、 取 50 µl 用于分析。

液 50µl/孔，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯

樣本稀釋倍數(shù)：1

色 15min。

六、 酶標(biāo)免疫分析程序:

10、 測定：加入終止液 50µl/孔，輕輕振蕩混勻，

設(shè)定酶標(biāo)儀于 450nm 處（建議用雙波長 450/63

u

測定前應(yīng)須知：

0nm 檢測，5min 內(nèi)讀數(shù)），測定每孔 OD 值。

1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫

（20～25℃）。

七、結(jié)果判定

2、 使用之后立即將所有試劑放回 2～8℃。

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第 1 種方

3、 在 ELISA 分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于

法，定量判定用第 2 種方法。注意樣本吸光度值與

洗板的*性，正確的洗板操作是 ELISA 測定

其所含氯霉素量成負(fù)相關(guān)。

程序中的要點。

1、粗略判定：

4、 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜

用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出

蓋住微孔板。

其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本 1 的吸光度值為 0.3，

u

操作步驟：

樣本 2 的吸光度值為 1.0，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：

1、 從 2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，室溫（20～

0ppb 為 2.243；0.05ppb 為 1.816；0.15ppb 為 1.415；

25℃）平衡 30min 以上，注意每種液體試劑使

0.45ppb 為 0.74；1.35ppb 為 0.313；4.05ppb 為 0.155。

用前均須搖勻。

則樣本 1 的濃度范圍是 1.35ppb～4.05ppb；樣本 2

2、 取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放

的濃度范圍是 0.15ppb～0.45ppb，乘以其對應(yīng)的稀

入自封袋，保存于 2-8℃。

釋倍數(shù)即為樣本中氯霉素實際濃度。

3、 配液：將 40ml 濃縮洗滌液（20 倍濃縮）用去

2、定量分析

離子水按照 1：19 稀釋（1 份濃縮洗滌液+19 份

（1）百分吸光率的計算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分

去離子水），或按所需用量配制洗滌液。

吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值（雙

4、 編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每

孔）除以*個標(biāo)準(zhǔn)（0 標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘

個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做 2 孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和

以 100%，即

樣本孔所在的位置。

B

5、 將濃縮抗體用樣本復(fù)溶液 11 倍稀釋（1 份抗體

百分吸光率（%）＝

×100%

加入 10 份稀釋液，按需配制使用）

B0

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

6、 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本 50µl/孔到各自的微孔中，然后加

B₀—0ng/ml 標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

加入抗體工作液 50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算

振蕩混勻。25℃環(huán)境中反應(yīng) 30min。

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以氯霉素標(biāo)準(zhǔn)